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检测前请仔细阅读说明书
Gene-Trak沙门氏菌微孔检测
用于沙门氏菌（Salmonella spp.）检测的DNA杂交方法
第一节
主要用途
本法旨用于食品类样品中沙门氏菌的定量检测，操作应由经过适当的微生物学实验培训的人员进行。
使用范围
对于多种商品中沙门氏菌的检测来说，Gene-Trak沙门氏菌微孔检测是一种有效的筛选方法。请与当地Neogen公司代表联系，索取已经验证适用本试剂盒检测的更新的物品名称明细表，也可以索取某一物品检测时的验证性研究材料。
生物学原理
DNA杂交时，采用了针对沙门氏菌DNA且直接标记了辣根过氧化物酶的特异性DNA为探针和显色性终点指示方法，如采用指定的富集方案，可检测含量低至1CFU/25g样品的沙门氏菌。如果吸光度A450小于0.1，则认为样品呈沙门氏菌阴性；如果吸光度A450大于或等于0.1，则认为样品呈阳性。对于阳性样品，应用标准的培养程序进行确认，再进行生化和血清学鉴定。
提供的材料
1裂解试剂浓缩液，2瓶，（标记为1a）
2裂解试剂缓冲液，1瓶，12ml，（标记为1b）
3杂交溶液，1瓶，18 ml，（标记为2）
4沙门氏菌探针溶液，1瓶，6ml，（标记为3）
5洗涤液，1瓶，25 ml，20×，（标记为4）
6底物显色溶液，1瓶，15ml，（标记为5）
7终止液，1瓶，5ml，（标记为6）
8阳性对照，1瓶，5 ml，（标记为+）
9阴性对照，1瓶，5 ml，（标记为-）
10微孔板，96孔，1块，可拆卸
11 杂交/探针溶液混合液稀释表
未提供的必需品
1 酶标仪（可读取450nm）(#9301或9302)
2 乳糖肉汤和/或其他预富集培养基（#7141）
3 连四硫酸盐肉汤（见参考文献1，#7241）
4 Rappaport-Vassiliadis肉汤（见参考文献1，#7512）
5 Gram阴性肉汤（见参考文献2，#7218）
6 培养箱，35±1℃（#9735）
7 培养箱，42±0.2℃（#9735）
8 培养箱，45±1℃（#9735）
9 玻璃试管，12*75mm（#9437）
10 试管架（#9440）
11 微量移液器，量程20-200μl，（#9276）
12 微量移液器吸头，量程1-250μl，（#9410）
13 计时器（#9426）
14 加热块，65±1℃（#9411）
15 洗瓶，500ml, (#9366)
16 滴管，10ml，（#9277）
17 无菌血清吸管，10ml，（#9415）
18 多通道可调微量移液器，（#9273）
不可由Neogen购得的材料
1 混合器或匀浆器
2 小型水平摇床，可设定转速150rpm
3 真空设备
4 培养瓶，用于样品预富集
5 培养试管，容积11ml
6 量筒，容积500ml
7 吸水纸
8 微孔板/条清洗装置，8通道
9 一次性刻度吸管，2ml
10 移液器及吸头，可吸取50，100，125，150μl
贮存要求
1 微孔板，阳性、阴性对照，试剂1a,2,3,5应该贮存于2-8℃
2 其他试剂可贮存于2-25℃
3 整个试剂盒应贮存于2-8℃
4 试剂1a配制好，必须贮存于-20℃中，这种条件下，可保存60天
5 使用前，试剂盒应平衡至室温，但不能长时间存放于常温下。
警告
1 试剂仅限于实验室使用。
2 终止液含有4N硫酸， 杂交液含有甲酰胺。应避免与皮肤联合黏膜等的接触。参考MSDS获得更多信息。
3 不同批次试剂盒中的试剂不能交换使用。沙门氏菌检测试剂盒中的试剂不能和其他Gene-Trak系列产品中的试剂交换使用。
4 不能使用过期的试剂。
5 由于存在潜在的感染性， 富集培养物应该处理后丢弃。
6对于污染材料，如培养物，移液器等，可取的处理方法是高压灭菌。
7 对于不可高压灭菌的物品，应该用消毒剂溶液处理后并用清水冲洗。
8 测试应该在常温条件下进行，还应考虑湿度、光照等。要求室温条件下温浴的步骤应在18-30℃进行。
第二节
样品置备与富集
注意：应按照适用于沙门氏菌分析的标准操作规程进行食物样品的取样和处理（见参考文献3）, 接种前，所有富集培养基应预热到室温。
适用于生食物及微生物含量高的样品之方法
1 匀浆食物样品于9倍体积的乳糖培养基中，35℃条件下培养22±2hr
2 取出预富集培养物并混合均匀。转移1ml预富集培养物到10ml连四硫酸盐肉汤。另转移0.1ml预富集培养物到10mlRV肉汤中，分别在42℃条件下培养16-18hr。
3 取出TT及RV培养物并混合均匀。转移1ml TT培养物到10mlGN肉汤中，转移1ml RV培养物到第二个10ml GN肉汤中，将GN肉汤都置于35℃条件下培养6hr。同时保存培养物TT和RV，以备确认之用。
4 用含两种GN肉汤（各0.2ml）混合物的沙门氏菌样品进行检测。保存GN培养物以备确认之用。
适用于所有样品（除上述两类外）的方法
1 按照BAM/AOAC的方法制备预富集培养物。35℃条件下培养22±2hr。
2 取出预富集培养物并混合均匀。转移1ml预富集培养物到10ml连四硫酸盐肉汤中。另转移0.1ml预富集培养物到RV肉汤中。将TT和RV培养6hr，温度分别为35和42℃。
3 取出TT和RV培养物并混合均匀。转移1mlTT培养物到10mlGN培养基中，转移1mlRV培养物到另外一个10mlGN培养基中。将GN在35℃条件下培养16-18hr。保存TT和RV培养物以备确认之用。
4 用含两种GN肉汤（各0.2ml）混合物的沙门氏菌样品进行检测。保存GN培养物以备确认之用。
注意：当培养结束后，必须马上进行检测。请勿将培养物保存一段时间后再检测。可咨询本公司。
第三节
检测之前请完成以下工作
1 打开水浴或加热块，并设定为65±1℃，加去离子水至大约1.5英寸的深度，或至加热槽之1/3。
2 配制裂解试剂，方法是将6ml裂解试剂缓冲液（#1b瓶）直接加入到裂解试剂中（#1a瓶）。轻摇溶解后置于冰上。注意：裂解试剂配好之后，在-20℃条件下，可稳定保存60天。解冻时将其放在室温下。解冻后，置于冰上（结冻和融解并不是按相反的方式影响试剂的性能。结冻和融解次数的增加都会使试剂失效。）
3 对于需检测的每一个样品，用适当的样品标记方法对一个12*75mm玻璃试管进行标记并置于试管架上。每一次实验应设置阳性阴性对照各一个。
4 配制洗涤液，方法是将浓缩洗涤液瓶子（#4瓶）中的全部溶液加入到475ml蒸馏水或去离子水中。将其转移到微孔板洗涤装置的储液槽中（阅读制造商提供的有关设置和使用的说明），或转移到一个500ml的挤压式洗瓶中进行手工洗涤。注意：洗涤溶液密封后可以在室温条件下储存60天。
5 配制4：1的杂交/探针混合溶液，方法是将杂交溶液（#2瓶）和探针溶液（#3瓶）混合在一个塑料或玻璃容器中。参考试剂盒中的溶液配比表或使用下列的公式计算：
N=检测的样品个数+对照（共2个）；
杂交液体积（#2瓶）=[（N*0.1）+1.6]ml；
探针溶液（#3瓶）=[（N*0.025）+0.4]ml
6 将合适数量的包被好的微孔放在架子上（请勿触摸微孔的底部），按从前到后，从左到右各8个为一排的方式放好，应包括试剂，阳性阴性对照的微孔。如果最后一排不足8个，则用试剂盒提供的底部有色的微孔补足。
检测步骤
注意：检测过程易于实现自动化。与本公司联系获得更多有关信息。
1 混合样品培养物（即GN培养物）。将每个样品的两个GN培养物各0.2ml加入到合适的试管中（将每个样品的两个GN培养物加入到一个试管中）。上下颠倒几次一混匀阳性阴性对照。将阴性和阳性对照各0.4ml加入到合适的试管中，即将阴性和阳性对照分别加入到不同的两个试管中！
2 将0.1ml配制好的裂解试剂（#1a瓶）加入到各试管中。用手轻轻摇动试管架5秒使其混合均匀。溶液应呈现兰色。如果有的试管不呈现兰色，请检查加入的试剂是否正确。将试管架（连同试管）置于65℃水浴中5min。
3 从水浴中取出试管架。转移0.145ml各裂解后的样品，包括对照，于标记好的微孔中。第一个微孔应留作试剂空白（对照），不加入任何样品。第二个、第三个微孔应分别作为阴性和阳性对照。
4 剧烈摇动预先配制好的杂交液/探针溶液。除了用作试剂空白（对照）的微孔外，向各微孔中加入0.125ml该溶液。
5 在室温下，将微孔板置于水平摇床上摇动2min，速度设定为150rpm（转/分）。
6 在45℃条件下温浴60min。
7 洗涤微孔。可选用下面的任一种方法。
A 用AOAC-RI方法#030201中推荐的微孔板清洗器在室温条件下洗涤5次。每一次清洗时，一次清洗8个微孔（即一条），方法是吸入洗涤液，注满微孔，然后下一条。最后一次洗涤结束后，吸出微孔中的液体，并倒置后用吸水纸吸出的方法祛除微孔中残留的所有液体。用轻压微孔板架的两边的方法拿住微孔板，并使板条处于合适的位置上。
B 用装满预先配制好的洗涤溶液的塑料瓶至少彻底洗涤微孔5次。方法是倒出微孔中液体于一合适的容器中，用吸水纸吸出倒置的微孔中的所有液体，用洗涤溶液充满微孔，剧烈摇动使微孔中液体流出。
8 向每个微孔中加入0.150ml底物显色溶液（#5瓶），包括用作试剂空白（对照）的微孔。室温下温浴20min。
9 向每个微孔中加入0.050ml终止液（#6瓶），包括用作试剂空白（对照）的微孔。
10 轻弹框子的一边几次使混合均匀。
11 按照制造商的使用说明用微孔板读数仪读取450nm波长处的吸光度值。用含有发色底物和终止液混合物的第一个微孔做空白（不能用空气做空白，即无溶液的微孔做对照）
第四节
结果解释
对照值:阴性对照的吸光度值必须≤0 .15，且阳性对照的吸光度值必须≥1.00。如果任何一个对照的吸光度值落在此可接受的范围之外，则检测是无效的，必须重新进行。
阴性判断标准：检测时产生的吸光度值<0.10，则样品可被认为是沙门氏菌阴性。
阳性判断标准：检测时产生的吸光度值>0.10，则样品可被认为是沙门氏菌阳性。判定为阳性的样品须按照标准的培养程序进行确认。
推荐的确认程序
本公司建议：阳性结果应该通过将样品的GN培养物和/或选择性富集培养物涂布于BAM或FSIS方案中所述的培养基上，这取决于样品的类型。注意：用BAM或FSIS方法对一个复制的亚样品（subsample）进行检测可能产生不同的结果。由于细菌不一定均匀地分布于一种样品中（干燥或固体类样品尤是如此），因此，亚样品可能不含有细菌（沙门氏菌）。
局限性
试剂盒中采用的探针不会与salmonella bongori血清型的沙门氏菌发生反应。
参考文献
1 U.S. Food and Drug Administration. 1998. Bacteriological Analytical Manual, 8th ed., Rev. A, AOAC International, Gaithersburg, MD, Appendix 3.
2 Atlas, R.M.2997. Handbook of Microbiological Media, 2nd ed., CRC Press, Boca Raton, FL,pg.606.
3 U.S. Food and Drug Administration. 1998. Bacteriological Analytical Manual, 8th ed., Rev. A, AOAC International, Gaithersburg, MD, Chapter 1.
4 U.S. Food and Drug Administration. 1998. Bacteriological Analytical Manual, 8th ed., Rev. A, AOAC International, Gaithersburg, MD, Chapter 5.
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MSDS信息
对于该试剂盒及所有食品安全检测试剂盒，通过登录Neogen网站www.neogen.com/msds.html,或打电话800/327-1619，517/372-9200至Neogen,以获得材料安全数据卡（MSDS）。
保险
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